БЮЛЕТЕНЬ

УДК 616.833-003.93:616-089.843:611-013.7/.8-018.8

Вплив трансплантації ембріональної нервової тканини
на регенерацію периферичних нервів

Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М., Носов А.Т., Чеботарьова Л.Л.,
Атанасов О.М., Сапон М.А.

Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України, м.Київ

Ключові слова: трансплантація, ембріональна нервова тканина, регенерація, стимуляція.

На сьогодні досягнуті досить значні успіхи в лікуванні хворих з наслідками травматичних ушкоджень периферичної нервової системи, які пов'язані з використанням мікрохірургічної техніки. Однак дуже багато питань діагностики і відновного лікування залишаються відкритими і потребують подальшого вивчення. Насамперед це стосується проблеми стимуляції регенерації нервових стовбурів після проведення реконструктивних операцій, а також вивчення процесів репаративного гістогенезу нервових стовбурів.

За останній час у деяких експериментальних дослідженнях, присвячених трансплантації ембріональної нервової тканини (ЕНТ) доведено, що нейротрансплантат сприяє частковому або повному відновленню пошкоджених рухових функцій. Це відбувається внаслідок відновлення морфофункціонального стану нервового апарату головного та спинного мозку. Проведені дослідження засвідчили, що трансплантація ЕНТ забезпечує більш повноцінне відновлення мікроциркуляторного судинного русла, посилює регенераційні можливості нейронів у зоні ушкодження, пригнічує реакції з боку сполучної тканини, внаслідок чого зменшуються розміри сполучнотканинного рубця [2, 3, 5, 6, 9-11].

Щодо впливу трансплантації ЕНТ на репаративний гістогенез периферичних нервів слід зазначити, що це питання і досі залишається відкритим. У найбільш близькій до нашого дослідження експериментальній роботі Е.И.Чумасова та співавторів [7] було встановлено, що імплантовані в периферичний нерв нейронні елементи ембріонального спинного мозку 17-добових ембріонів щурів не лише зберігають свою життєздатність , але й диференціюються від нейробластів до зрілих нейронів, причому не виключена можливість утворення синаптичних зв'язків із паростками нейронів реципієнта. За даними Е.С.Петровой [4], найкращим матеріалом для трансплантації є ембріональні елементи спинного мозку 7-8-добових ембріонів щурів, що обумовлено їх більшою здатністю до диференціювання та позитивним впливом на вогнище ушкодження.

Нами проведено дослідження на 60 білих щурах-самцях масою близько 200 г, яким під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсола та реланіума на ізотонічному розчині натрію хлориду розрізали сідничний нерв на межі верхньої та середньої третини стегна з одного боку, а потім накладали епіпериневральний шов ниткою 10/0, використовуючи операційний мікроскоп. Половині тварин у зону шва субепіневрально було виконано трансплантацію ЕНТ (дослідна група). Використовували тканину спинного мозку 8-добових ембріонів, об'єм трансплантації становив близько 0,5 мм³ у кожному випадку.

Аналізуючи різні показники, які характеризують процеси регенерації нервових стовбурів в експерименті, ми віддали перевагу морфологічним та електрофізіологічним методам дослідження. Контроль за відновленням функції нерва здійснювали через 2 та 8 тиж після оперативного втручання за допомогою електронейроміографії. Потім тварин умертвляли.

З метою проведення тваринам електрофізіологічного дослідження застосовували перитонеальний наркоз сумішшю каліпсола та реланіума на ізотонічному розчині натрію хлориду. Після розрізу шкіри вздовж проекції сідничного нерва на оперованій та інтактній кінцівках тупо розшаровували тканини. Сліди крові змивали ізотонічним розчином натрію хлориду, повністю очищуючи операційне поле.

Стимулюючі електроди у вигляді двох платинових голок діаметром 0,22 мм із загнутими кінчиками, які було зафіксовано в тефлоновій канюлі на відстані 2,5 мм одна від одної, підводили під нерв якомога проксимальніше лінії шва. Реєструючі електроди, змонтовані подібним до стимулюючих способом, підводили під нерв якомога дистальніше лінії шва, при цьому відстань між стимулюючими та реєструючими електродами становила близько 2 см і була однаковою на обох кінцівках.

Електрофізіологічне дослідження виконували за допомогою комп'ютерного аналізатора біопотенціалів "BASIS" фірми ОТЕ Biomedica (Італія). Стимулювання проводили імпульсами тривалістю 0,05 мс, частотою 1/с. Силу стимуляції вибирали індивідуально залежно від реакції тварин. Вона становила від 15 до 40 мВ. Реєстрацію потенціалу дії (ПД) та М-відповіді здійснювали одночасно на 8 каналах з усередненням по 4 відповіді при часовому розгортанні 10 мс на поділку, фільтрах пропускання низьких частот 10 Гц, високих - 20 кГц. Швидкість регенерації нерва оцінювали за показником латентного періоду потенціалу дії (ЛППД) нерва (мс) та М-відповіді - прямої м'язової відповіді на стимуляцію цього нерва (мс). Якість регенерації оцінювали за амплітудою ПД нерва (мкВ) та М-відповіді (мкВ).

Отримані результати представлені на мал. 1 і 2.

Мал.1.Ступінь відновлення функції нервово-м'язового апарату через 2 тиж після операції

Мал.2.Ступінь відновлення функції нервово-м'язового апарату через 8 тиж після операції

Суттєвість різниці оцінювалася за критерієм Вілкоксона і становила р<0,05.

Отримані електронейроміографічні показники дозволяють оцінити функціональний стан нервових стовбурів і м'язових структур, слідкувати за динамікою регенерації, об'єктивізувати ступінь втрати чи відновлення функції нервово-м'язових утворень, а також визначити стан механізмів компенсації нервово-м'язової системи [1]. Аналіз наведених на мал. 1 і 2 даних свідчить, що у тварин експериментальної групи з комбінованим втручанням (зшивання нерва + трансплантація ЕНТ) майже за всіма показниками відновлення функції нерва та м'яза через 2 тиж після операції було значно кращим, а через 8 тиж переваги комбінованого методу ставали ще більш вираженими.

Світлооптично та електронно-мікроскопічно досліджували сідничний нерв у ділянці рубця, проксимальний та дистальний відрізки при звичайному зшиванні нерва та з урахуванням введення в зону ушкодження ЕНТ. Напівтонкі зрізи (500-1000 Б ) забарвлювали метиленовим синім і піроніном та досліджували у світловому мікроскопі, а ультратонкі (500 Б) забарвлювали за Рейнтгольдцем і досліджували в електронному мікроскопі ЕМ-400Т фірми "Філіпс".

Під час гістологічного дослідження нерва у тварин контрольної групи виявляли досить виражені дистрофічно-деструктивні зміни: у ділянці шва архітектоніка була повністю порушеною, зустрічалися атрофічно змінені аксони, цілість їх мієлінової оболонки була також порушеною. Крім того, виявляли щільні мієлінові утворення, які розташовувались в товщині нервового волокна у вигляді краплеподібних включень, а також збільшені осміофільні аксони з напливами нейроплазми, різко виражений інтерстиціальний та периваскулярний набряк. У частині судин спостерігали пристінкові тромби. Подібні зміни, хоча й менш виражені, відзначалися і в дистальному відрізку нерва. На відміну від лінії шва, гістоархітектоніка в цій ділянці деякою мірою збережена, але в аксонах спостерігалися виражені "напливи" нейроплазми. Окремі аксони змінювалися за типом валерівської дегенерації. Ці зміни також супроводжувалися досить вираженим набряком інтерстицію та порушеннями з боку мікроциркуляторного судинного русла. Що стосується проксимального відрізку нервового волокна, то порушення в цій зоні були значно меншими, ніж у ділянці шва та дистальному відрізку, і проявлялися переважно процесами інтерстиціального набряку, дистрофічними змінами частини аксонів та дегенеративними змінами за типом валерівської дегенерації і демієлінізації. Ендоневрій внаслідок набряку був різко розширеним, хоча в цілому гістоархітектоніка нервового волокна була збереженою.

Під час електронно-мікроскопічного дослідження ушкодженого нерва були виявлені досить істотні дистрофічно-дегенеративні зміни шванівської оболонки нервових волокон, при цьому вони мали однотипний характер в усіх досліджуваних ділянках і відрізнялися лише ступенем вираженості. Так, у зоні рубця переважали різко виражені деструктивні зміни шванівських клітин, аж до руйнування останніх з виходом органел до периневрального простору. В частині шванівських клітин дистального та проксимального відрізків відзначалася різного ступеня вираженості деструкція внутрішньоклітинних органел за наявності вакуольноі та жирової внутрішньоклітинної дистрофії. Тонковолокниста структура мієлінових волокон була порушена, мієлінова оболонка була представлена гомогенною неструктуйованою субстанцією. В більшості нервових волокон спостерігалася деструкція периневральних оболонок, що призводило до порушення бар'єрної функції нервового волокна. Стінки основної кількості мікросудин, розташованих в ендо- та периневрії, були дистрофічно змінені. Спостерігалися різкий набряк ендотеліального прошарку, плазмоцитоз, порушення цілості внутрішньоклітинних органел. При цьому мікропіноцитозна активність практично повністю була відсутня, в частині судин цитоплазма ендотеліоцитів була повністю зруйнована, розвивався пристінковий тромбоз.

На відміну від вищезгаданої групи при трансплантації ЕНТ у ділянці шва зустрічалися в достатній кількості мієлінізовані аксони на фоні помірного периневрального набряку, явищ гіпо- та гіперхроматозу аксональних відростків. Вздовж аксонального відростка спостерігалися напливи нейроплазми. У дистальній ділянці ушкодженого нерва гістоархітектоніка нервового волокна досить добре відновлювалася і вже було можливо розрізнити окремі пучки нервових волокон на фоні незначного периневрального набряку, напливів нейроплазми вздовж осьових циліндрів та дистрофічно зміненої фрагментованої мієлінової оболонки. В проксимальному відрізку морфологічні параметри нервового волокна майже наближалися до норми, хоча й спостерігалися явища набряку та деякого вогнищевого подразнення аксонів.

У тварин, яким в ушкоджений нерв було проведено трансплантацію, під час електронно-мікроскопічного дослідження були виявлені такі зміни. У зоні шва та дистального відрізка нерва спостерігалися досить виражені гіперпластичні процеси, які сприяли відновленню структурної цілості нервових волокон. Насамперед виявляли поліпшення мікроциркуляції з явищами гіпертрофії ендотеліальних клітин, особливо в маргінальній частині ендотеліоцитів. Мікропіноцитозна активность була досить значною. Доречно зазначити, що периваскулярний набряк був значно меншим, ніж у контрольній групі, судини з явищами пристінкового тромбозу майже не зустрічалися.

Важливими ознаками відновлення ушкодженого нерва були гіперплазія та проліферативна активність шванівських клітин, найбільш виражені в дистальному відрізку та в зоні шва нерва. При значному збільшенні мікроскопа було досить добре помітно, як відростки шванівської клітини, проникаючи по периневральному простору, оточували окремі нервові волокна, а в цитоплазмі цих відростків спостерігалися внутрішньоклітинні органели та мікропіноцитозні бульбашки. За ходом нервових волокон зустрічалися гіпертрофовані шванівські клітини з досить великим ядром, що займало більшу частину цитоплазми, з численними органелами та добре контурованою мієліновою оболонкою. В усіх досліджуваних відділах ушкодженого нерва спостерігалися різного ступеня вираженості регенераційні процеси з боку мієлінової оболонки, формувалися молоді мієлінові волокна. Ці процеси були найбільш виражені в зоні шва та в дистальному відрізку нерва.

Таким чином, проведені нами дослідження досить переконливо свідчать про значне поліпшення процесів репаративного гістогенезу периферичних нервів після трансплантації ЕНТ, що проявлялося не тільки прискоренням, але й покращенням якості регенерації нервових волокон. Ми вважаємо, що такий позитивний вплив зумовлений наявністю в ЕНТ ростових факторів; поліпшенням регенерації аксонів за рахунок підвищення проліферативної активності шванівських клітин, особливо в зоні ушкодження та в дистальній ділянці; поліпшенням мікроциркуляторного кровообігу в ділянці шва нерва; створенням додаткового центру нейротрофічної регуляції та поліпшенням взаємодії проростаючих нервових волокон зі сполучнотканинним оточенням внаслідок можливої імуносупресивної дії нейротрансплантата. Все це прискорює регенерацію ушкоджених периферичних нервів, що сприяє відновленню насамперед рухових функцій після проведення реконструктивних оперативних втручань на нервових стовбурах.

Список літератури

1.Лобзин В.С., Ласков В.Г., Жулев Н.М. Травмы нервов.-Воронеж: Изд-во ВГУ, 1989.-192с.

2.Лосева Е.В., Цымбалюк В.И., Пичкур Л.Д., Брагин А.Г. Влияние трансплантации эмбриональной мозговой ткани на структурные изменения в мозгу крыс после черепно-мозговой травмы// Нейрофизиология.- 1996, N5/66-С.350-360.

3.Отелин В.А., Гилярович Е.Г. Интрапаренхиматозная трансплантация нервной ткани как модель изучения гистогенеза и регенерации ЦНС человека//Развивающийся мозг.-Тбилиси: Изд-во АН ГССР.-1984.- С.167-168.

4.Петрова Е.С. Имплантация эмбриональной ткани мозга в периферический нерв// Механизмы регуляции физиологических функций: Тез. докл.- Л.,1988.-С.105.

5.Цимбалюк В.I. Хірургічне лікування церебрального паралічу// Актуальні проблеми неврології і нейрохірургії: Зб. наук-практ. робіт, присвячених 10-річчю організації кафедри неврології і нейрохірургії факультету удосконалення лікарів-провізорів.-Львів: Львів.держ.мед.ін-т, 1996.-С.238.

6.Цимбалюк В.I., Пічкур Л.Д. Трансплантація ембріональної нервової тканини як метод лікування дитячого церебрального паралічу// VI Конгрес Світової Федерації українських лікарських товариств (9-14 вересня 1996 р.): Тез. доп.-Одеса, 1996.-С.88.

7.Чумасов Е.И., Светикова К.М., Петрова Е.С., Мирошникова М.Е. Репаративная регенерация нервной ткани ЦНС и ПНС и разработка методов восстановления нервных стволов// Диагностика и лечение поражений периферической нервной системы: Сб. науч. трудов.- Л.: Изд-во ЛНХИ им. А.Л.Поленова, 1989.-С.96-101.

8.Шевелев И.Н. Клиника, диагностика и микрохирургическое лечение травматических повреждений плечевого сплетения: Автореф. дис. … д-ра мед.наук.-М., 1990.-20с.

9.Brundin P., Nelsson O., Streeker R. Behavioral effecte of human fetal dopamine neurons in a at model of Purkinson's diases// Exp. Brain Res.- 1986.- V.65, N1.- P.235-240.

10.Tsymbaliuk V.I., Pichkur L.D., Scherba I.N., Rasskazov S.Y. Embrionic neocortical grafts in experimental traumatic brain injurу and the first clinical tria// Abstracts. Symposium on interdisciplinary neurosurgical aspects. 14-16 December, 1996. Islamic center state of Kuwait, P.20.

11.Wallace R.B., Harnsbeger J.R. A behavioral and histological analysis of rats receiving homotopic neural transplants in total cortex// Abstr. Symp.: Transplantation in the mammalian CNS.- London, 1984.-P.49.

Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на регенерацию
периферических нервов

Цымбалюк В.И., Сулий Н.Н., Лузан Б.Н., Носов А.Т.,
Чеботарёва Л.Л., Атанасов О.М., Сапон Н.А.

В статье обобщены некоторые результаты трансплантации эмбриональной нервной ткани при повреждениях периферических нервов. В ней отражены особенности процесса регенерации нервов в условиях введения эмбриональной нервной ткани в зону шва.

По данным экспериментальных наблюдений, процессы регенерации поврежденных нервов при трансплантации эмбриональной нервной ткани значительно улучшаются. Это проявляется увеличением скорости прорастания нервных волокон и их миелинизации, улучшением микроциркуляции крови в зоне повреждения, ослаблением реакции соединительнотканного окружения и замедлением дифференцировки ее элементов, уменьшением соединительнотканного рубца. Эти данные подтверждаются электрофизиологическими и морфологическими методами исследования.

Embryonal nervous tissue graft affect at the peripheral nerves regeneration

V.Tsymbaliuk, M.Sulij, B.Luzan, A.Nosov, L.Chebotarjova, O.Atanasov, N.Sapon

The article represents a summary of some results embryonal nervous tissue transplantation into injured peripheral nerves. In it are reflected morphological and electrophysiological feature of nerves regeneration under reconstructional operations in conditions embryonal nervous tissue graft into suture zone.

The authors according to their own observation point to considerable improvement of regeneration process in injured periferal nerves under embryonal tissue graft into nerve suture zone. This improvement reveals itself in amplification speed of nervous fibres germination and their mielinization, in the betterment of blood microcirculation in injured zone, in the abatement reaction of surrounding connective tissue along with slowing down differentiation of its elements and the decrease connective tissue scar in nerve suture zone too.

This data proved correct within electrophysiological and morphological reserch methods used.