БЮЛЕТЕНЬ

УДК: 616-003.93:612.81

Влияние ацетилхолина и атропина
на регенерационную неврому седалищного нерва у крыс

Грабовой А.Н.

Национальный медицинский институт им. А.А.Богомольца, г.Киев, Украина

Ключевые слова: седалищный нерв, регенерационная неврома, ацетилхолин, атропин.

Проблема регенерации нервных проводников привлекала и продолжает привлекать к себе пристальное внимание исследователей в области биологии и медицины [11, 12]. В частности, получен ряд данных о том, что как различные клеточные элементы регенерационной невромы, так и нервные волокна имеют рецепторы к катехоламинам и ацетилхолину [3, 13, 14, 15]. В то же время, имеющиеся в литературе данные о роли нейротрансмиттерных систем в регуляции регенерации нервов получены в условиях системных изменений содержания медиаторов в организме или при системном введении нейротропных препаратов [2, 9, 10]. Непосредственные же реакции регенерирующих элементов нервной системы на нейротрансмиттеры практически не изучались [13].

Цель настоящей работы - изучить реакции регенерационной невромы седалищного нерва у крыс на локальное воздействие ацетилхолина и атропина.

Исследования проведены на 105 белых крысах в возрасте 5 мес весом 150 - 170 г. Под тиопенталовым наркозом (50 мг/кг) производили разрез кожи и фасции по задней поверхности правого бедра. Тупым путем разъединяли мышцы и осуществляли невротомию седалищного нерва на уровне середины бедренной кости. Рану ушивали послойно, операционное поле обрабатывали 5% раствором йода. Изучение зависимости "доза - эффект" влияния ацетилхолина и атропина на регенерационную неврому проведено на 12 группах по 5 животных в каждой группе. В 1-й группе поврежденный нерв не подвергали дополнительным воздействиям. На 11, 12 и 13-й день опыта остальным животным в область невротомии шприцем вводили 0,2 мл следующих растворов: во 2-й группе - изотонический раствор натрия хлорида, в 3-7-й группах - растворы ацетилхолина хлорида (АХ), в 8 - 12-й группах - растворы атропина сульфата (АТ). Исходные водные растворы действующих веществ имели следующие концентрации: АХ - 10 г/л, АТ - 1 г/л. Перед введением в область травмы нерва их разводили изотоническим раствором натрия хлорида в 100, 1000, 10 000, 100 000 и 1000 000 раз. Материал для исследования брали через 14 сут после невротомии. Изучение реакций регенерационных невром на воздействие АХ и АТ на различных этапах восстановительного процесса проведено на 9 группах по 5 крыс. Им 3 раза на протяжении 3 дней, предшествующим забору материала, в область невротомии вводили изотонический раствор натрия хлорида или растворы действующих веществ (в концентрациях: АХ - 0,01 г/л, АТ - 0,001 г/л - разведение 1/1000 исходных растворов). Регенерирующие нервы изучали через 3, 7 и 28 дней после начала опыта. Забор материала осуществляли после эвтаназии животных внутрибрюшинным введением тиопентала натрия (200 мг/кг). Седалищные нервы, включая неврому, фиксировали в 10% нейтральном формалине 24 ч и заливали в парафин [7]. Гистологические срезы толщиной 8 и 30 мкм изготавливали при помощи автоматического микротома НМ360 (Carl Zeiss Jena GmbH). Для морфометрии отбирали срезы, толщина которых после окраски и заключения, при определении высшей и низшей точки среза [1] и увеличении объектива x100 микроскопа Axioplan (Carl Zeiss Jena GmbH), отличалась не более чем на ±0,2 мкм. Срезы толщиной 8 мкм окрашивали азур II-эозином и галлоцианин-хромовыми квасцами. На 5 гистологических срезах каждой невромы, окрашенных галлоцианин-хромовыми квасцами, в 6 участках площадью 130x130 мкм на каждом срезе, подсчитывали количество фибробластов и нейролеммоцитов. Срезы толщиной 30 мкм импрегнировали азотнокислым серебром [6]. Определение удельной длины регенерирующих нервных волокон в регенерационной невроме проводили в 4 участках площадью 65х65 мкм на каждом из 5 срезов каждой невромы методом линейного интегрирования [1] при помощи окулярной сетки с 40 линиями длиной 12,9 мкм. Полученный цифровой материал обрабатывали стандартными статистическими методами с вычислением среднего значения, среднего квадратичного отклонения, ошибки среднего значения, коэффициента достоверности среднего значения, критерия Стьюдента.

Изучение зависимости "доза-эффект" влияния АХ и АТ на регенерационную неврому седалищного нерва показало, что через 14 сут после невротомии у животных контрольных групп неврома представляет собой утолщение седалищного нерва, соединяющее его центральный и периферический отрезки. В ней обнаруживаются рыхлая сеть тонких коллагеновых волокон, значительные количества нейролеммоцитов и фибробластов, умеренное число макрофагов, немногочисленные полиморфноядерные лейкоциты и лимфоциты. Гемомикроциркуляторное русло невромы представлено в основном не имеющими определенной ориентации тонкостенными сосудами. Проникновение их в регенерат происходит как со стороны центрального и периферического отрезка поврежденного нерва, так и с его поверхности. Нервные волокна в невроме в это время выявляются в значительном количестве. Часть из них ориентирована вдоль оси нерва и проникает в его периферический отрезок, другие располагаются без видимой ориентации. Введение в область травмы изотонического раствора натрия хлорида не вызывало статистически достоверных изменений содержания в регенерационной невроме фибробластов и нейролеммоцитов, а также удельной длины регенерирующих нервных волокон (табл. 1).

1/100

1/1 000

1/10 000

1/100 000

1/1 000 000

Удельная длина нервных волокон в регенерационной невроме

Удельное содержание фибробластов в регенерационной невроме

Удельное содержание нейролеммоцитов в регенерационной невроме

Регенерационная неврома, формирующаяся в условиях воздействия больших доз АХ (разведения исходного раствора 1/100 и 1/1000), визуально оказывается утолщенной и обильно инфильтрированной макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами. В ней несколько возрастает, по сравнению с контролем, содержание нейролеммоцитов и фибробластов, а также увеличивается ее васкуляризация. Кровеносные микрососуды часто расширены и переполнены кровью. Плотность расположения регенерирующих нервных волокон в невроме в условиях действия АХ несколько уменьшается, причем только относительно небольшая их часть ориентирована вдоль оси нерва.

Введение больших доз АТ в область травмы (разведения 1/100-1/1000 исходного раствора) приводит к уменьшению размеров регенерационной невромы. В ней снижается выраженность воспалительной инфильтрации, а также содержание клеток фибробластического ряда и нейролеммоцитов. Кровеносных микрососудов в регенерате обнаруживается несколько меньше, чем в контроле. Они имеют небольшой диаметр и более выраженную продольную ориентацию. Новообразованные нервные волокна проявляют большую, по сравнению с контролем, тропность к периферическому отрезку нерва и относительно большая их часть ориентирована вдоль его оси.

Морфометрия также показала, что АХ увеличивает, а АТ уменьшает содержание фибробластов и нейролеммоцитов в регенерационной невроме (см.табл. 1). Удельная же длина регенерирующих нервных волокон изменяется в обратном порядке, т.е. АТ увеличивает, а АХ уменьшает значение этого показателя. Степень отклонения количественных значений всех изученных показателей от контрольных уменьшается по мере снижения концентрации действующих веществ, а графики зависимости "доза - эффект" приближаются к S-подобной (логистической) кривой.

Для оценки реакций регенерационной невромы на АХ и АТ на разных этапах репаративного процесса использовали разведения исходных растворов этих веществ 1/1000, что наиболее близко к верхней части отрезка линейной зависимости графиков "доза - эффект".

Через 3 дня после невротомии в контролях на концах центральных отрезков пересеченных нервов наряду с клетками воспалительной инфильтрации обнаруживается небольшое количество фибробластов и клеток периферической глии. Нервные волокна центрального отрезка нерва вблизи его конца утолщены, имеют неровные контуры и неравномерно импрегнируются. Находящиеся здесь нейролеммоциты увеличены в размерах, а их цитоплазма выглядит более светлой, чем в участках нерва, удаленных от места повреждения. В начавшей формироваться невроме обнаруживаются умеренное количество клеточных элементов и единичные тонкостенные микрососуды, диаметр которых варьирует в значительных пределах. На этом этапе эксперимента лишь изредка можно наблюдать регенерацию нервных волокон и их выход за пределы центрального отрезка поврежденного нерва.

В это время в условиях воздействия АХ на поврежденный нерв наблюдается более значительное, чем в контроле, расширение предсуществующих кровеносных сосудов центрального, особенно периферического отрезка нерва, переполнение их кровью и тромбоз некоторых из них. Отмечается усиление, по сравнению с контролем, явлений отека, диапедеза эритроцитов, а также воспалительной инфильтрации тканей в области травмы. Нисходящая дегенерация при воздействии АХ оказывается более выраженной, чем в контроле, что приводит к отчетливой фрагментации осевых цилиндров. Формирующаяся регенерационная неврома между отрезками пересеченного нерва имеет относительно большой объем, содержит больше фибробластов и значительное количество лейкоцитов и макрофагов. В регенерате увеличивается количество кровеносных сосудов, которые обычно имеют большой диаметр. Признаки регенерации осевых цилиндров в этих условиях практически отсутствуют.

У крыс, в область травмы нерва которым вводили АТ, клеточная и сосудистая реакции, а также явления восходящей дегенерации выражены слабее, чем в контроле. Обнаруживаются лишь единичные короткие веточки регенерирующих осевых цилиндров, проникающие в неврому. Количество кровеносных сосудов в ней оказывается меньшим, чем в контроле, обычно они более узкие, и в них редко наблюдается краевое стояние лейкоцитов.

Через 7 сут после начала эксперимента в невроме у животных контрольных групп в центральном отрезке нерва уменьшаются, по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, явления раздражения нервных проводников, а в периферическом отрезке они уже разделяются на фрагменты различной длины. К этому времени в регенерате увеличивается количество кровеносных микрососудов, возрастает содержание фибробластов и нейролеммоцитов, уменьшается воспалительная инфильтрация и появляются в небольшом количестве тонкие коллагеновые волокна. В невроме уже выявляется множество регенерирующих нервных волокон, значительная часть которых не имеет отчетливой ориентации вдоль оси нерва.

У животных, которым в область травмы вводили АХ, наблюдаются более выраженные, по сравнению с контролем, явления нисходящей дегенерации, осевые цилиндры оказываются разделенными на мелкие фрагменты. В центральном отрезке нерва наблюдается некоторое усиление, по сравнению, с контролем выраженности явлений раздражения нервных проводников. В это время между концами пересеченного нерва определяется утолщенная регенерационная неврома, в которой имеется множество лейкоцитов и макрофагов. Вместе с тем отмечается увеличение в регенерате количества фибробластов и нейролеммоцитов, а также кровеносных микрососудов. Последние, как правило, расширены и переполнены кровью, а их эндотелий выглядит набухшим. . В условиях воздействия АХ визуально отмечается некоторое уменьшение плотности регенерирующих нервных проводников в невроме, которые, кроме того, имеют менее упорядоченное, по сравнению с контролем, расположение.

Регенерационная неврома, подвергшаяся действию АТ, через 7 сут после начала опыта содержит меньше, по сравнению с контролем, кровеносных сосудов и клеток с воспалительной инфильтрацией. Новообразование и проникновение в неврому нервных волокон в этих условиях происходят в большем объеме, и нередко они достигают периферического отрезка нерва.

Через 28 дней после невротомии у животных всех групп регенерационные невромы состоят из соединительной ткани и содержат большое количество нервных волокон, основная часть которых обычно проникает в периферический отрезок нерва. Воздействие АХ на неврому на этом этапе эксперимента приводит к увеличению содержания в ней количества кровеносных сосудов. Их продольная ориентация в новообразованном участке нерва менее выражена, чем в контроле, и органоспецифические сосудистые сплетения четко не различаются. При этом микрососуды часто расширены, переполнены кровью, а около их эндотелия сравнительно часто располагаются лейкоциты. Это сопровождается увеличением, по сравнению с контролем, содержания в невроме макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, фибробластов и нейролеммоцитов. Плотность расположения нервных волокон в регенерате незначительно уступает той, что наблюдается в контроле. Относительно часто встречаются нервные проводники, расположенные без определенной ориентации. В периферическом отрезке перерезанного нерва в условиях воздействия АХ значительно чаще, чем у животных контрольной группы, обнаруживаются спирали Пиррончито.

В регенератах у крыс, которым вводили АТ, обнаруживают меньше, чем в контроле, клеточных элементов, а вполне дифференцированные кровеносные микрососуды формируют уже хорошо различимые эпи-, пери- и эндоневральные сети. У этих животных отмечается также некоторое увеличение плотности расположения новообразованных нервных волокон.

Морфометрическая оценка показывает, что при воздействии холинотропных веществ на неврому наибольшее относительное отклонение, по сравнению с контролем, содержания в ней фибробластов отмечается на 3-и - 7-е сутки после невротомии, а затем этот показатель быстро снижается (табл. 2). Относительное же изменение количества нейролеммоцитов в этих условиях постепенно плавно снижается в динамике эксперимента. Различная степень изменения содержания фибробластов и нейролеммоцитов в регенерате в ответ на воздействие изучаемых веществ приводит к изменению их соотношения (см.табл. 2). К 3-м суткам после начала эксперимента АТ достоверно увеличивает относительное содержание в регенерате фибробластов, а к 28-м суткам АХ достоверно увеличивает относительное содержание нейролеммоцитов. Относительное изменение удельной длины регенерирующих нервных волокон невромы при воздействии АХ постепенно снижается в ходе опыта. В ответ же на воздействие АТ происходит существенное увеличение относительного отклонения этого показателя с последующим быстрым его снижением.

3

7

14

28

Удельная длина нервных волокон в регенерационной невроме

КФ

АХ

АТ

Содержание фибробластов в регенерационной невроме

КФ

12,31±0,36

27,04±0,61

29,97±0,93

25,33±0,53

АХ

14,81±0,44* /120,2%

32,72±,69* /121,0%

34,69±0,81* /115,7%

27,98±0,54* /110,4%

АТ

10,27±0,33* / 83,4%

22,23±0,49* / 82,2%

26,21±0,56* / 87,4%

22,62±0,47* / 89,3%

Содержание нейролеммоцитов в регенерационной невроме

КФ

АХ

АТ

Таким образом, проведенные исследования показали, что холинотропные препараты могут существенно изменять состояние формирующейся регенерационной невромы. АТ уменьшает, а АХ увеличивает содержание в регенератах фибробластов и нейролеммоцитов. Кроме того, АХ через 3 сут и АТ через 28 сут после невротомии изменяют соотношение клеточных элементов в составе соединительнотканного регенерата. АТ увеличивает, а АХ уменьшает удельную длину регенерирующих нервных волокон в невроме. Полученные графики зависимости "доза - эффект" имеют вид S-образных (логистических) кривых и позволяют предполагать специфичность выявленных реакций, что согласуется с данными, полученными на других экспериментальных моделях [4, 5, 13, 14]. Поскольку блокаторы рецепторов к нейротрансмиттерам не имеют природных аналогов в организме [8], реакции невромы на АТ позволяют подтвердить "от противного" специфичность роли холинореактивных систем и выявить участие эндогенного АХ в регуляции процесса посттравматической регенерации седалищного нерва. Реакции различных тканевых компонентов регенерационной невромы на АХ и АТ носят не только количественный, но и качественный характер, а выраженность относительной реакции зависит от фазы восстановительного процесса. Учитывая подобие реакций соединительнотканных и нейральных компонентов невромы на воздействие АХ и АТ при посттравматической репарации кожи [4, 5] и седалищного нерва, можно полагать, что они являются характерными в целом для регенерирующих соединительной ткани и элементов периферической нервной системы.

Список литературы

1.Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М., Медицина, 1990.- 384 с.

2.Бернштейн А.Л. Влияние карбахолина на регенерацию перерезанного периферического нерва //Сб. науч. работ, посвящ. 70-летию проф. Сеппа Е.К. - М.: Медгиз, 1948.- С. 63-70.

3.Бродский С.В., Сидорова А.Г., Баранов В.Ф. Холинэстеразы как синхронизаторы регенерации нервов //Арх. анатомии.- 1993.- Т. 105, N 9-10.- С. 53.

4.Грабовой А.Н. Влияние норадреналина, ацетилхолина, пропранолола и атропина на клеточный состав грануляционной ткани //Вісн. морфології.- 1996.- T. 2, N 1.- C. 65-68.

5.Грабовий О.М. Реакції нервового апарату раневих регенератів шкіри на дію нейротрансміттерів //Укр. наук.-мед. молодіж. журн.- 1997.- N 1-2.- С. 9-12.

6.Грабовой А.Н. Импрегнация серебром элементов периферического отдела нервной системы в материале залитом в парафин // Укр. журн. мед.техніки і технології.- 1997.- N 3-4.- С. 34-36.

7.Грабовий О.М., Проша М.В. Ізопропанол-целоїдин-парафіновий метод заливки матеріалу для гістологічних досліджень. - Там же.- 1994.- N 1-2.- С. 44-47.

8.Денисенко П.П. Роль холинореактивных систем в регуляторных процессах.-М.: Медицина, 1980.- 296 с.

9.Лазарева К.П. Об участии ацетилхолина и адреналина в механизме изменения функциональных свойств регенерирующих толстых мякотных нервных волокон у лягушки //Патофизиология инфекционных процессов и аллергии: Тр. Саратов. мед. ин-та.- Т. 61/78.- Вып. 3.- Саратов, 1969.- C. 46-49.

10.Фомина Л.В., Швырев А.А. Изменение параневрального русла ишемизированных бедренного и седалищного нервов при воздействии ацетилхолинахлорида //10-й Всесоюзный съезд анатомов, гистологов и эмбриологов: Тез. докл.- Полтава, 1986.- С. 362.

11.Челышев А. Ю. Факторы поддержания регенерации периферических нервов //Успехи физиологических наук.- 1995.- Т. 26, N 3.- С. 57-77.

12.Brecknell J.E., Fawcett J.W. Axonal regeneration //Biol. Rev. Camb. Philos. Soc.- 1996.- V. 71, N 2.- P. 227-255.

13.Kater S.B. Neuronal growth cone regulation by neurotransmittens //Int. J. Dev. Neurosci.- 1986.- V. 4, Suppl. N 1.- P 38.

14.Saito S., Komiya Y., Igarashi M. Muscarinic acetylcholine receptors are expressed and enriched in growth cone membranes isolated from fetal and neonatal rat forebrain. Pharmacological demonstration and characterization//Neuroscience.- 1991.- V. 45, N 3.- C. 735-745.

15.Schreurs J., Seelig T., Schulman H. b2-Adrenergic receptors on peripheral nerves //J. Neurochem.- 1986.- V. 46, N 1.- P. 294-296.

Вплив ацетилхоліну та атропіну
на регенераційну неврому
сідничного нерва у щурів

Грабовий О.М.

Вивчено локальну дію ацетилхоліну (АХ) та атропіну (АТ) на питому довжину нервових волокон, вміст фібробластів та нейролемоцитів у регенераційній невромі (РН) сідничного нерва білих щурів. Дія різних доз АХ (11-13-й день після травми) на РН призводить до зменшення питомої довжини регенеруючих нервових волокон і збільшення кількості фібробластів та клітин глії, прискорює процеси дегенерації. АТ спричиняє протилежні зміни в РН. Ступінь відхилення кількісних значень вивчених показників збільшується в міру підвищення дози діючих речовин, а графіки залежності "доза - ефект" наближаються до S-подібної кривої. Найбільша зміна кількості фібробластів в РН при дії АХ та АТ відзначається на 3-тю - 7-му, а нейролемоцитів - на 7-му - 14-ту добу досліду. Максимальна зміна питомої довжини регенеруючих нервових волокон відзначається при дії АХ на 7-му, а АТ- на 7-му - 4-ту добу експерименту.

Influence of acetylcholine and atropine on regeneration neuroma
of the sciatic nerve at rats

Grabovoy A.N.

Local influences of acetylcholine (AC) and atropine (AT) on specific length of nervous fibers, number of fibroblasts and Schwann cells in regeneration neuroma (RN) of a sciatic nerve were studied upon white rats. Influence of different dosages on RN (11-13 day after injury) AC results in reduction of specific length of regenerating nervous fibers; in the increase of quantity of fibroblasts and Schwann cells; accelerates processes of descending and ascending degeneration. AT - cause opposite changes in RN. The degree of deviations of quantitative meanings of investigated parameters increased in accordance with increase of a dosage of working substances, and the diagrams of dependence "dosage-effect" come nearer to S-like shape. The greatest change of fibroblasts at influence of AC and AT is observed by 3-7 days of experiment, and Schwann cells - by 7-14 days. The maximum change of specific length of regenerating nervous fibers is observed at influence of AC by 7, and AT by 7-14 days of experiment.